sgrna设计要点

本篇文章给大家分享sgrna设计网站，以及sgrna设计要点对应的知识点，希望对各位有所帮助。

简述信息一览：

• 1、CRISPR-Cas9系统:sgRNA的设计及质粒构建
• 2、CRISPR中sgRNA的设计
• 3、使用benchling网站设计sgRNA

CRISPR-Cas9系统:sgRNA的设计及质粒构建

质粒构建步骤： 载体选择：***用LentiCRISPRV2载体，含有两个B***BI酶切位点。 酶切与连接：使用B***BI内切酶打开载体所需区域，设计并退火寡核苷酸链引物，通过T4连接酶将sgRNA与载体连接。 转化与检测：质粒转化***用Stbl3感受态细胞，进行PCR检测和琼脂糖凝胶电泳分析。 测序鉴定：挑选阳性菌落送至测序公司进行测序鉴定。

CRISPR-Cas9系统是基因编辑领域的一次革命，其基本工作原理涉及CRISPR序列对目标DNA的特异性识别、crRNA（或sgRNA）的生成、以及Cas9蛋白的复合与目标DNA的结合，最终引发DNA双链断裂。细胞通过非同源末端连接或同源重组修复机制，实现基因组的精准编辑，为疾病治疗和基因研究提供了创新性工具。

FrCas9是由舒桐科技自主研发的新型CRISPR/Cas9系统，其切割效率高、脱靶效应低、特异性好、PAM限制少，显著优于SpCas9。选择舒桐科技的优势包括：sgRNA设计服务、sgRNA质粒构建服务以及高纯度、高活性的Cas9蛋白。

CRISPR中sgRNA的设计

sgRNA设计原则： 特异性：确保sgRNA高度特异性，避免非特异性编辑。 GC含量平衡：GC含量应维持在4060%之间，以提高杂交效率。 避免多剪切位点：sgRNA在基因组中不应存在多个剪切位点，减少非预期的多基因编辑。 避免重复或高度相似序列：降低非特异性剪切的可能性。 无稳定二级结构：确保sgRNA在实验条件下的有效性。

CRISPR中sgRNA的设计需要遵循以下原则：长度与结构：长度为20nt：sgRNA通常是一个20个碱基大小的合成RNA。PAM序列：需要在基因组中寻找PAM序列，其形式为NGG，“N”可以是A、T、C、G中的任意一个。碱基组成：避免4个以上的T结尾：以减少转录过程中的不稳定性。

sgRNA是一个20bp大小的合成RNA，可以与Cas9蛋白结合，因此在设计sgRNA之前，需要在基因组中寻找PAM序列（Protospacer Adjacent Motif），其形式为NGG，“N”可以是A、T、C、G中的任意一个。sgRNA的作用类似于向导，引导Cas 9蛋白在特定序列上进行切割。

sgRNA的设计过程包括NCBI基因信息检索、特定编辑区域选择、同源区识别、转录本序列下载与分析、共外显子识别、sgRNA序列输入至设计网站、评分与脱靶位点分析，最终获得设计好的sgRNA序列，并送至合成公司进行合成。

CRISPR/Cas9是一种强大的基因编辑工具，由Cas蛋白和sgRNA两部分组成。在设计sgRNA时，需遵循特定原则。首先，sgRNA长度应为20 nt（化脓链球菌）或22 nt（啮齿粪杆菌）。其次，sgRNA序列应避免出现TTTT终止信号，GC含量建议为40%-60%。

CRISPR/Cas9实验设计方法主要包括以下步骤和原则：确定靶基因及靶位点：在目标基因中选定需要编辑的区域，通常选择对基因功能有重要影响的区域，如编码区、启动子等。设计sgRNA：长度：确保sgRNA的长度为20nt。碱基组成：sgRNA序列应位于PAM序列前，避免以4个以上的T结尾，GC含量保持在30%70%。

使用benchling网站设计sgRNA

使用benchling网站设计sgRNA，需要遵循以下步骤：首先，通过Google账号进行登陆，或创建新的账号。随后，点击创建新项目并选择CRISPER类别下的CRISPER guides。接下来，进行序列的导入步骤。您可以通过以下两种方式操作：方法一：自己粘贴序列。例如，输入如下序列：CAACTACAAGACCCGCGCCG AGG。

以人源TP53基因为例，Benchling设计流程如下：登录Benchling网站，创建sgRNA文件，导入DNA序列（如从Snapgene文件），选择靠近ATG的第一外显子设计sgRNA靶点。通过选择设计类型（单靶点或多靶点）、靶点长度（默认20bp）、物种、PAM序列等参数进行设计。

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