sgeRNA设计网站

本篇文章给大家分享sgeRNA设计网站，以及史上最全设计网站对应的知识点，希望对各位有所帮助。

简述信息一览：

• 1、CRISPR/Cas9实验实操专题一:sgRNA设计
• 2、CRISPR-Cas9系统:sgRNA的设计及质粒构建
• 3、使用benchling网站设计sgRNA
• 4、CRISPR/Cas9实验设计方法
• 5、只需5步,快速学会CRISPR/Cas9的sgRNA设计

CRISPR/Cas9实验实操专题一:sgRNA设计

1、CRISPR/Cas9实验中sgRNA设计的关键要点如下：靶点选择与设计原则：聚焦于20nt的靶点，适用于II型CRISPR系统。确保sgRNA序列的碱基组成遵循NGG的PAM序列规则。避免sgRNA序列以4个以上的T结尾。保持GC%含量在30%70%之间。提高匹配度与效率：力求sgRNA与Ontarget的匹配尽可能高，确保编辑效率。

2、一般情况下，针对一个靶基因设计4-5条sgRNA，从中筛选出活性较高的1-2条进行后续实验。此步骤对CRISPR/Cas9实验的成功至关重要，确保了基因编辑的精确性和效率。

3、扩大培养与提取：基于测序结果挑选目标菌落进行扩大培养，提取质粒以备后续实验使用。总结：CRISPRCas9系统的sgRNA设计与质粒构建过程需严格遵循科学原则和实验流程，以确保基因编辑的精准性与安全性，为生物医学研究与疾病治疗提供有力支持。

4、匹配度：sgRNA序列与靶位点的匹配数应尽可能高，一般大于60认为是可用的。转录效率：如果构建U6启动子或T7启动子驱动的sgRNA表达载体，需考虑sgRNA的5碱基为G或GG以提高转录效率。选择和设计Cas9蛋白：根据实验需求选择合适的Cas9蛋白变体，如SpCasSaCas9等。

5、CRISPR/Cas9是一种强大的基因编辑工具，由Cas蛋白和sgRNA两部分组成。在设计sgRNA时，需遵循特定原则。首先，sgRNA长度应为20 nt（化脓链球菌）或22 nt（啮齿粪杆菌）。其次，sgRNA序列应避免出现TTTT终止信号，GC含量建议为40%-60%。

CRISPR-Cas9系统:sgRNA的设计及质粒构建

1、质粒构建步骤： 载体选择：***用LentiCRISPRV2载体，含有两个B***BI酶切位点。 酶切与连接：使用B***BI内切酶打开载体所需区域，设计并退火寡核苷酸链引物，通过T4连接酶将sgRNA与载体连接。 转化与检测：质粒转化***用Stbl3感受态细胞，进行PCR检测和琼脂糖凝胶电泳分析。

2、CRISPR-Cas9系统是基因编辑领域的一次革命，其基本工作原理涉及CRISPR序列对目标DNA的特异性识别、crRNA（或sgRNA）的生成、以及Cas9蛋白的复合与目标DNA的结合，最终引发DNA双链断裂。细胞通过非同源末端连接或同源重组修复机制，实现基因组的精准编辑，为疾病治疗和基因研究提供了创新性工具。

3、FrCas9是由舒桐科技自主研发的新型CRISPR/Cas9系统，其切割效率高、脱靶效应低、特异性好、PAM限制少，显著优于SpCas9。选择舒桐科技的优势包括：sgRNA设计服务、sgRNA质粒构建服务以及高纯度、高活性的Cas9蛋白。

使用benchling网站设计sgRNA

使用benchling网站设计sgRNA，需要遵循以下步骤：首先，通过Google账号进行登陆，或创建新的账号。随后，点击创建新项目并选择CRISPER类别下的CRISPER guides。接下来，进行序列的导入步骤。您可以通过以下两种方式操作：方法一：自己粘贴序列。例如，输入如下序列：CAACTACAAGACCCGCGCCG AGG。

若设计的guide RNA经过终止密码子，benchling可能提示未检测到序列，这是正常的。完成guide RNA和同源臂的设计后，将所有同源互补模板粘贴回你的质粒。在此过程中，在质粒两端分别添加guide RNA及PAM序列。

以人源TP53基因为例，Benchling设计流程如下：登录Benchling网站，创建sgRNA文件，导入DNA序列（如从Snapgene文件），选择靠近ATG的第一外显子设计sgRNA靶点。通过选择设计类型（单靶点或多靶点）、靶点长度（默认20bp）、物种、PAM序列等参数进行设计。

常用的sgRNA设计工具有Broad Institute GPP和Benchling等。以Benchling为例，可以通过设置相关参数进行sgRNA的设计。设计流程与载体构建：登录设计工具网站，创建sgRNA文件，并导入目标基因的DNA序列。选择合适的位置进行设计。获得多个靶点设计后，选择评分较高的靶点进行保存或导出。

CRISPR/Cas9实验设计方法

匹配度：sgRNA序列与靶位点的匹配数应尽可能高，一般大于60认为是可用的。转录效率：如果构建U6启动子或T7启动子驱动的sgRNA表达载体，需考虑sgRNA的5碱基为G或GG以提高转录效率。选择和设计Cas9蛋白：根据实验需求选择合适的Cas9蛋白变体，如SpCasSaCas9等。

sgRNA设计流程包括以下原则： sgRNA长度：SpCas9一般为20nt。 sgRNA序列碱基组成：基因特异的sgRNA模板序列位于PAM序列前，PAM序列特征为NGG （N为任意核苷酸），选择3末端含有GG的sgRNA，可构成PAM序列。sgRNA序列应避免以4个以上的T结尾，GC含量最佳为30%-70%（40%-60%）。

登录设计工具网站，创建sgRNA文件，并导入目标基因的DNA序列。选择合适的位置进行设计。获得多个靶点设计后，选择评分较高的靶点进行保存或导出。若需构建载体，则选择靶点并点击Assemble，选择载体并完成相关设置。获取FWD和REV引物序列，退火后连接到载体上。

转化与检测：质粒转化***用Stbl3感受态细胞，进行PCR检测和琼脂糖凝胶电泳分析。 测序鉴定：挑选阳性菌落送至测序公司进行测序鉴定。 扩大培养与提取：基于测序结果挑选目标菌落进行扩大培养，提取质粒以备后续实验使用。

点击Assemble。选择载体，点击Next，设置保存位置，完成Assemble步骤。最后，针对选定的靶点，获取FWD和REV引物序列，退火后连接到载体上即可。一般情况下，针对一个靶基因设计4-5条sgRNA，从中筛选出活性较高的1-2条进行后续实验。此步骤对CRISPR/Cas9实验的成功至关重要，确保了基因编辑的精确性和效率。

只需5步,快速学会CRISPR/Cas9的sgRNA设计

1、设计流程分为五个步骤：选择编辑类型、输入基因序列、设定spacer长度、导出sgRNA信息以及挑选合适的sgRNA。第一步，选定编辑目标，比如敲除基因。第二步，输入基因序列，支持raw或fasta格式，序列长度需小于10000bp。第三步，选择spacer长度，如19nt，系统将扫描基因正反链上的所有可能sgRNA序列。

2、输入序列信息，选择正确的物种和Cas9蛋白。网站会生成sgRNA序列信息，包括序列、PAM、特异性评分、切割效率评分和潜在的脱靶位点。此外，CHOPCHOP和E-CRISP也是设计sgRNA和预测脱靶的工具。每个网站的评分规则不同，设计时需综合考虑。

3、质粒构建步骤： 载体选择：***用LentiCRISPRV2载体，含有两个B***BI酶切位点。 酶切与连接：使用B***BI内切酶打开载体所需区域，设计并退火寡核苷酸链引物，通过T4连接酶将sgRNA与载体连接。 转化与检测：质粒转化***用Stbl3感受态细胞，进行PCR检测和琼脂糖凝胶电泳分析。

4、转录效率：如果构建U6启动子或T7启动子驱动的sgRNA表达载体，需考虑sgRNA的5碱基为G或GG以提高转录效率。选择和设计Cas9蛋白：根据实验需求选择合适的Cas9蛋白变体，如SpCasSaCas9等。构建表达载体：将设计好的sgRNA序列和Cas9蛋白基因克隆到适当的表达载体中，确保它们能够在目标细胞中正确表达。

5、CRISPR/Cas9实验中sgRNA设计的关键要点如下：靶点选择与设计原则：聚焦于20nt的靶点，适用于II型CRISPR系统。确保sgRNA序列的碱基组成遵循NGG的PAM序列规则。避免sgRNA序列以4个以上的T结尾。保持GC%含量在30%70%之间。提高匹配度与效率：力求sgRNA与Ontarget的匹配尽可能高，确保编辑效率。

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